Técnica PCR

Qué es la técnica PCR y cómo se utiliza para un correcto diagnóstico en veterinaria

La reacción en cadena de la polimerasa es una técnica de biología molecular conocida como PCR (sus siglas en inglés Polymerase Chain Reaction), descrita en 1986 por Kary Mullis.

Por lo general, la PCR es una técnica común y normalmente indispensable en laboratorios de investigación médica y biológica para una gran variedad de aplicaciones.

La técnica PCR es utilizada en veterinaria para la detección directa, rápida y precisa de ADN y ARN de diversos microorganismos patógenos que infectan a nuestras mascotas, abarcando desde aquellos de lento crecimiento como Mycoplasma, a los que no pueden ser cultivados como el virus del Herpes.

 

Cómo funciona la técnica PCR

La técnica PCR se fundamenta en la propiedad natural de las polimerasas para replicar hebras de ADN y tiene como objetivo obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN, por lo que es posible partir de muy pequeñas cantidades de un agente infeccioso y realizar una detección fiable del mismo.

La técnica se basa en la amplificación de una pequeña secuencia de ADN o ARN específica de cada patógeno. Se diseñan cuidadosamente los Primer u Oligos, que son secuencias cortas que deben servir de cebadores a la polimerasa (enzima encargada de copiar las bases de forma complementaria a la hebra molde de ADN). Entonces, una vez copiados estos pequeños fragmentos, se amplifican durante varios ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse para que las polimerasas vuelvan a duplicarlas.

De esta forma, se genera una cantidad detectable del patógeno. Si el ADN del patógeno no estuviese presente, los Primer no tendrían donde “pegarse” y no habría al final un fragmento amplificado.

 

La importancia de los controles

Un aspecto importantísimo dentro de la técnica de PCR son los controles, tanto positivo como negativo.

Es fundamental que el fragmento de ADN utilizado como control positivo del patógeno sea absolutamente específico para esa pareja de Primer y ninguna más.

El control negativo de la PCR es una reacción que no lleva ADN, y debe dar negativa para confirmar que no hay contaminación en ninguno de los reactivos utilizados y que la técnica en sí ha ido bien.

Errores en el diseño de estas secuencias, tanto del control positivo como de los Oligos, pueden traducirse en consecuencias fatales para las mascotas mal diagnosticadas.

 

 

Cómo utilizar la PCR para un correcto diagnóstico en veterinaria

Muchas veces el diagnóstico en veterinaria se puede tornar en una tarea complicada ya que al tratarse de diversos agentes patógenos, que cursan con diferentes ciclos vitales, estadíos complicados, incluso enfermedades secundarias, el veterinario debe estar muy pendiente de qué técnica es la más adecuada para el diagnóstico de cada enfermedad, ya que muchas presentan peculiaridades que pueden afectar dando falsos negativos.

Un caso peculiar es el de Leishmania infantum, en la cual el parásito tiene la capacidad de mantenerse mucho tiempo retenido en órganos como los ganglios, siendo difícil su diagnóstico por PCR ya que no se encuentra en sangre circulante. En este caso, después de haber obtenido un resultado positivo, lo adecuado sería realizar el seguimiento de la titulación de anticuerpos.

 

Ventajas de la PCR

Entre los diferentes beneficios de diagnosticar utilizando la PCR es que permite detectar la infección en estadíos muy tempranos, gracias a su alta sensibilidad y especificidad, permitiendo de esta forma tratar al animal antes de que la enfermedad avance o incluso descartar falsos negativos cuando la titulación es aún muy leve.

Por ejemplo, en casos de perros infectados con Borrelia burgdorferi, bacteria responsable de la enfermedad de Lyme, los anticuerpos no se desarrollarán hasta entre cuatro y seis semanas después de que la garrapata haya transmitido la bacteria y los títulos pico pueden ocurrir meses después. En cambio, con la PCR se podría detectar de forma muy temprana.

En el caso de la Leptospirosis es de vital importancia que la infección sea detectada en estadíos muy tempranos ya que la exposición directa o indirecta a la orina de un animal infectado se traduce en una posible infección para los seres humanos. Aquí radica otra de las más importantes de las ventajas, ya que más allá de favorecer a que nuestras mascotas obtengan un rápido diagnóstico para empezar su tratamiento cuanto antes, se puede evitar el que se produzcan transmisiones a los humanos en casos de enfermedades infectocontagiosas zoonóticas.

 

Particularidades de la técnica PCR

Una particularidad de la PCR frente a pruebas de titulación de anticuerpos es la necesidad de que la recogida de la muestra sea la adecuada para cada patología, mientras que para los anticuerpos se realiza una sencilla extracción de sangre. A continuación exponemos varios ejemplos significativos:

• Para la PCR de Parvovirus es necesario realizar la extracción de ADN a partir de una muestra de heces.
• En el caso del Calicivirus felino la muestra más idónea para realizar PCR es a partir de un hisopo sin medio del cual se han recogido secreciones nasales del gato.
• En el caso del moquillo canino el momento ideal para extraer sangre periférica es el pico febril.

Por otra parte, realizar un diagnóstico diferencial en base sólo al título de anticuerpos puede generar confusiones, ya que no siempre podemos descartar ciertas infecciones basándonos únicamente en un título de anticuerpos, ya sea positivo o negativo. Lo recomendable sería realizar ambas técnicas: una prueba serológica para determinar si hubo exposición, y luego PCR para confirmar el diagnóstico, afirmando que el paciente en efecto está infectado con ese microorganismo.

 

Recomendaciones para clínicas veterinarias

Para garantizar una extracción de ADN o ARN exitosa siempre debe remitirse con rapidez al laboratorio una muestra biológica adecuada, que dependerá del patógeno a identificar, ya sea sangre entera en tubo EDTA, saliva o heces, entre otras.

Debe tenerse en cuenta la información sobre el manejo de muestras en veterinaria.

Las clínicas veterinarias de todas las Islas Canarias pueden contactar con Laboratorio Finca España en Tenerife para realizar cualquier consulta, solicitar nuestro catálogo de precios de pruebas de veterinaria, o en caso de necesitar materiales para la recogida de muestras. Estamos a su disposición, consulte nuestros datos de contacto y nuestro horario (no cerramos al medio día).

Disponemos de una hoja de petición de análisis para facilitar las solicitudes de analíticas por parte de las clínicas veterinarias.